简介
该成果取得的主要成效:(1)筛选广东11个市(县)种植花生土壤中黄曲霉拮抗菌,获得一株能抑制黄曲霉菌生长的绿色木霉菌(T-vGZ101)。通过抑菌实验表明T-vGZ101发酵液对黄曲霉菌丝生长和孢子萌发有显著抑制作用,且能抑制毒素的产生并降解黄曲霉毒素B1;田间试验表明,该发酵液能降低花生收获前黄曲霉毒素污染,降低率达97%,同时能较大程度地抑制土壤中黄曲霉菌的生长。
(2)对拮抗剂T-vGZ101抑制黄曲霉菌的活性物质经过初步分析,确定为活性蛋白。活性物质经多步分离纯化,最后通过双向电泳、质谱检测,发现抗菌活性物质为两个蛋白。
(3)基于抗菌蛋白质的氨基酸序列,通过RACE克隆技术得到这两个抗黄曲霉蛋白,根据同源比对分析表明其中一个蛋白为碱性蛋白酶基因(TvALP1),另一个蛋白为碳水化合物结合蛋白家族13蛋白Ricin蛋白(TvRicin)。其中TvALP1全长1233bp,编码410个氨基酸,分子量为43.85 kDa,等电点为9.21。SignalP分析其含有一段长为20个氨基酸的信号肽序列。TvRicin基因ORF全长444bp,编码147个氨基酸,分子量是16310.9,等电点是8.82。
(4)利用毕赤酵母表达载体分别构建了野葛葡糖基转移酶基因TvALP1的胞外和胞内表达载体(pPICZαΑ-TvALP1和pPICZΑ-TvALP1)。继而以重组质粒转化表达宿主菌GS115,梯度浓度抗生素Zeocin筛选获得了多拷贝重组菌株,并进行了诱导培养,SDS-PAGE检测结果表明TvALP1蛋白已在宿主菌中实现诱导表达。胞内表达的蛋白浓度高于胞外表达,但与其他蛋白在毕赤酵母中的表达相比,浓度较低。
(5)分离纯化了重组蛋白TvALP1并进行酶活性检测。体外抑菌结果表明该重组蛋白TvALP1对黄曲霉生长、毒素的产生有较强抑制作用,琼脂扩散法测定最小抑菌浓度为7.5μg/well。